Uz čitav niz novih eksponata koje srećemo u Washingtonu, u ovoj bici pridružuje im se i čitav niz starih likova iz prvog filma. Među novim je likovima i najgori zlikovac kojeg je Larry dosad imao priliku sresti - oživljeni egipatski faraon Kahmunrah (Hank Azaria), stariji i okrutniji brat faraona Ahkmenraha iz prvog filma. Taj zli faraon namjerava muzej Smithsonian pretvoriti u svoju bazu, odakle će njegova podzemna vojska preuzeti kontrolu nad cijelim svijetom.

U filmu 'Noć u muzeju: bitka kod Smithsoniana' Larry se našao u potpuno novoj situaciji. Uspio je kao informatički izumitelj, obogatio se i postao slavan, ali čini se da je izgubio nešto vrlo važno u životu, iako ni sam ne zna što. No uletjevši u ovu novu avanturu u muzeju Smithsonian, koja će zauvijek promjeniti njegov život, odjednom postaje svjestan važnosti prijateljstva i koliko je sjajno slijediti vlastite sulude zamisli. Larryjeva nova avantura uključuje još jednu primamljivu stvar: ljubavnu aferu s jednom od najprivlačnijih i najtajanstvenijih žena svih vremena, Amelijom Erhard

Rijetko koja žena simbolizira avanturistički duh kakav je bila Amelia Erhard, avijatičarka koja je promjenila povijest svojim solo letovima koji su pobili sve dotadašnje stereotipe, što je imalo ogroman utjecaj na kasnije generacije žena. Poznata po svojoj mudrosti, duhovitosti i nevjerojatnoj neovisnosti, Amelia je dobila nadimak Lady Lindy nakon što je kao prva žena samostalno preletjela Atlantik. Bila je na vrhuncu slave kad je 1937. godine nestala negdje iznad Pacifika, ali je i danas omiljena junakinja obožavateljima širom svijeta i unutar muzeja Smithsonian. Amelia će za Larryja predstavljati još više od toga, jer tijekom ove nevjerojatne noći u muzeju Smithsonian iznenada slijeće u njegovo srce. Kako bi dostojno prikazali Ameliju, autori filma bili su svjesni da moraju angažirati glumicu s ogromnom količinom karizme i stila, a to su pronašli u Amy Adams, mladoj zvijezdi koja je nedavno primila drugu nominaciju za Oskara.

Sve nevolje u muzeju Smithsonian počinju onoga trena kad čarobni svitak zadužen za oživljavanje muzejskih eksponata probudi i faraona Kahmunraha, umišljenog starijeg brata faraona Akhmenraha, s kojim je Larry ostvario sjajno prijateljstvo u njujorškom Prirodoslovnom muzeju. Prilično zle volje nakon 3000 godina spavanja, Kahmunrah je sada odlučio ostvariti svoj dugo sanjani san: otvoriti vrata Podzemlja i osloboditi zatočenu vojsku – pa makar to morao učiniti, kao što bi neki neuki ljudi komentirali, u suknji.

Još jedan novi prijatelj Larryja Daleyja je čovjek koji je najpoznatiji po svojoj najvećoj pogrešci: general Custer, vojni vođa tijekom američkog Građanskog rata koji će zauvijek ostati zapamćen po svojem porazu u Bici kod Little Big Horna. Custera, koji nastoji ponovno pronaći vlastitu hrabrost, igra najveći komičarski talent današnjice Bill Hader, vodeći član trenutačne postave emisije 'Saturday Night Live' te zvijezda brojnih komedija, uključujući Ben Stillerov film 'Tropska grmljavina'.

Od ostalih likova tu su još povijesni zlikovci Ivan Grozni, Napeoleon i Al Capone, koje glume Christopher Guest, Alain Chabat i Jon Bernthal, te stari likovi - kauboj Jedediah, general Oktavijan i Teddy Roosevelt, a njih, kao i u prvom nastavku, tumače Owen Wilson, Steve Coogan i Robin Williams